Nació en Madrid en 1535, hija de Carlos V y de Isabel de Portugal, y hermana por tanto de Felipe II. La obligan a casarse con el heredero al trono portugués y ella acepta el sacrificio. Con él engendra a su único hijo, Sebastián, del que se tiene que separar cuando el pequeño cuenta tres meses y ella se queda viuda. Carlos V le pide que regrese a España y ella renuncia a su hijo, propiedad de la corona portuguesa. Nunca más le volverá a ver.
El emperador le había cedido parte de su imperio a su hermano Fernando y el reino de España a su hijo Felipe, al que debían apoyar Juana y María, sus hermanas. Mientras Felipe está en Inglaterra debido a su matrimonio con María Tudor, Juana se convierte en la regente del reino. Lo único que ella exige a cambio es que nunca se la obligará a casarse en contra de su voluntad.
Juana es una mujer enormemente preparada, que a los ocho años domina el latín a la perfección y que toca varios instrumentos. Gobierna el reino con inteligencia y tesón, incluso en la difícil época de la Contrarreforma, y llegó a enfrentarse con su hermano a causa de la política fiscal e internacional.
Desde su retiro de Yuste Carlos sabe que en su reino hay conatos de calvinismo en Sevilla y Valladolid, y el viejo emperador le recomienda a su hija la regente que ponga coto a la rebeldía religiosa mediante juicios sumarísimos. Juana firma un decreto en donde prohíbe la importación de libros y la salida de estudiantes desde España a universidades extranjeras. En mayo de 1559 se celebran en Valladolid varios autos de fe, en los que catorce personas son condenadas a la hoguera. Juana lo presencia todo con estoicismo. Cuando, después de la muerte de María Tudor Felipe regresa a España, su hermana permanece a su lado.
Juana se enfrenta al dolor de ver como entre los libros prohibidos está uno de Francisco de Borja, uno de sus grandes apoyos, el cual tiene que huir a Portugal para librarse de la Inquisición. La antaño regente ingresa, dentro del anonimato, en la orden jesuita y se la conoce como Mateo Sánchez. Muere antes de cumplir los cuarenta años el 8 de septiembre de 1573 sin conocer el dolor de la muerte de su hijo Sebastián en la batalla de Alcazarquivir.